在免疫检查点阻断的情况下,双歧杆菌改变肠

BifidobacteriumaltersthegutmicrobiotaandmodulatesthefunctionalmetabolismofTregulatorycellsinthecontextofimmunecheckpointblockade

ShanSun,LingjieLuo,WenhuaLiang,QianYin,JingGuo,AnthonyM.Rush,ZhibaoLv,QimingLiang,MichaelA.Fischbach,JustinL.Sonnenburg,DylanDodd,MarkM.Davis,FengWang

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesNov,(44)-;DOI:10./pnas.1921223

免疫检查点阻断疗法已成为一种非常成功的癌症治疗方法。第一个被批准用于临床的单克隆抗体（mAb）对用于黑色素瘤治疗的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）具有特异性。然而，免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用可引起多种甚至致命的自身免疫反应，其中腹泻和结肠炎是最常见和最严重的。

肠道微生物群中的成分已被证明可调节宿主的抗肿瘤免疫反应一些研究表明，肠道微生物群在调节免疫检查点阻断疗法的疗效方面起着重要作用。例如，双歧杆菌的存在可以刺激宿主免疫系统以CD8+T细胞依赖的方式对抗PD-L1治疗作出反应。

尽管这些研究已经证明了微生物群在抗肿瘤免疫中的作用，但是与检查点抗体诱导的自身免疫相关的潜在事件仍然是难以捉摸的。在临床上，ICI治疗后出现结肠炎的患者肠道细菌组成与无结肠炎患者不同。最近的一项研究报告了第一个临床病例，其中通过粪便微生物群移植重建肠道微生物群成功地挽救了ICI相关结肠炎。肠道微生物群的基线也显示与伊普利单抗的临床反应相关，粪便杆菌的富集与长期临床益处和结肠炎一致。我们之前报道过双歧杆菌的使用在不损害小鼠CTLA-4抗肿瘤功能的情况下减轻了肠道炎症。在这里，我们剖析了控制益生菌诱导的微生物组优化与CTLA-4阻断结果之间关系的基本原则。我们证明双歧杆菌系统地改变了肠道微生物群的组成，深刻地增加了其他益生菌种类，乳酸杆菌。这种微生物组优化依赖于调节性T细胞（Tregs）的存在。此外，我们还发现，这种改变的共生群落增强了肠道Tregs的代谢和抑制功能，有助于在CTLA-4阻断条件下维持局部免疫稳态。综上所述，我们的观察揭示了控制微生物群动力学复杂功能的免疫学原理，以及双歧杆菌到乳酸杆菌在改善免疫检查点阻断相关结肠炎中的中继机制。

双歧杆菌以Treg依赖的方式系统地改变肠道微生物群

我们的发现活双歧杆菌介导的CTLA-4诱导的免疫病理调节需要Tregs，这使我们想知道Tregs是否直接影响肠道微生物组成。为了回答这个问题，我们使用了Foxp3DTR小鼠，它携带一个白喉毒素受体在树突状细胞上，使树突状细胞的短暂消耗。我们从粪便样本中分离DNA，并进行16srrna测序，以比较对照组和Treg缺失小鼠的肠道细菌群落。主成分分析表明，双歧杆菌混合物治疗导致基因型群与野生型和Treg缺失小鼠的PBS治疗组不同。特别是，我们发现双歧杆菌混合物治疗不仅显著增加了对照组小鼠中双歧杆菌的丰度，而且还显著增加了乳酸杆菌、肠杆菌和克罗诺杆菌的丰度，而在Treg缺失的小鼠中，这些细菌的丰度显著降低，甚至降至无法检测的水平。

双歧杆菌和乳酸杆菌都是众所周知的益生菌，据报道参与肠道内稳态。我们之前的数据显示，双歧杆菌在Treg缺失的小鼠中失去了功能，而Treg缺失的小鼠也缺乏乳酸杆菌，这表明这两种细菌之间存在免疫状态相关的相互作用。我们还发现双歧杆菌治疗显著改变了Treg缺失小鼠体内梭状芽胞杆菌、厌氧菌、脱外消旋菌和消化荚膜菌的百分比，而对照小鼠没有显著变化。此外，双歧杆菌增加了对照组和Treg缺失小鼠的肠杆菌和足球菌的丰度，表明双歧杆菌诱导的这些细菌丰度的变化与肠道免疫环境无关。

从双歧杆菌属和乳酸杆菌属鉴定的结肠炎改善菌株

我们进一步测试了先前实验中使用的四种双歧杆菌的混合物中的每种双歧杆菌菌株。我们发现短双歧杆菌的管理，而不是其他双歧杆菌株或PBS控制，防止体重下降CTLA-4-治疗小鼠结肠炎，证明B.短杆菌可能是改善结肠炎的关键功能菌株。由于我们的数据显示了双歧杆菌和乳酸杆菌在属水平上的丰度之间的相关性，我们随后用不同的乳酸杆菌菌株（包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌）灌胃小鼠，以测试它们是否影响对结肠炎的易感性。我们发现L.鼠李糖治疗可显著减少结肠炎小鼠的体重减轻。与这一发现相一致，苏木精-伊红（HE）结肠切片染色显示两组结肠结构部分恢复，浸润到肠组织的白细胞减少。短纤维处理和L.鼠李糖治疗小鼠。这两种菌株还导致血清炎症细胞因子IL-6、CSF3和KC水平降低。因此，我们可以确定鼠李糖是CTLA-4阻断时改善肠道免疫病理的两种功能菌株。

双歧杆菌通过促进IL-10/IL-10Rα增强Treg功能自我刺激回路

接下来我们研究了双歧杆菌对肠道树突的影响，这是双歧杆菌保护功能所必需的。我们首先分析了双歧杆菌处理和PBS处理小鼠结肠固有层（LP）Tregs的基因表达模式。火山图显示，双歧杆菌治疗增加了几个关键的炎症相关基因，如Il10rα,Cxcr5和Il17rα。流式细胞术证实IL-10Rα的表达双歧杆菌治疗后，结肠中LPTregs增加，这些Tregs中的细胞内IL-10水平也增加，但在其他细胞中没有增加。这些数据表明双歧杆菌促进了IL-10/IL-10Rα肠树状细胞中的自我刺激环。

因为IL-10信号对于增强Treg功能和维持肠道内稳态很重要接下来，我们在体外检测了结肠树突状细胞的抑制功能。我们发现，与经双歧杆菌处理的Tregs共培养的效应T细胞比与经PBS处理的Tregs共培养的效应T细胞显示出较少的增殖，这表明这种类型的肠道微生物增强了它们的抑制功能。

IL-10和IL-22均参与双歧杆菌对结肠炎的改善作用

为了进一步分析IL-10在双歧杆菌功能中的作用，我们用IL-10基因敲除（KO）小鼠分析CTLA-4阻断双歧杆菌治疗条件下的结肠炎症状。我们观察到，与接受相同治疗的野生型（WT）小鼠相比，Il-10KO小鼠的体重减轻更严重。IL-22与IL-10R具有共同的免疫调节功能，在维持肠道内稳态方面具有重要作用。因此，我们使用IL-22中和抗体来测试在CTLA-4阻断期间清除这种细胞因子对双歧杆菌介导的结肠炎缓解的影响。我们发现抗体治疗的小鼠比不相关抗体治疗的小鼠体重减轻更多。具体来说，双歧杆菌治疗组小鼠的平均体重从对照组初始体重的90%降低到%～DSS（葡聚糖硫酸钠）给药后第10天，抗IL-22注射组初始重量的70%。与这一发现一致，结肠切片的HE染色显示抗IL-22抗体治疗或IL-10KO小鼠的白细胞浸润更多，肠道结构损伤更严重。抗白细胞介素-22治疗和白细胞介素-10敲除也增加了血清中炎性细胞因子白细胞介素-6、CSF3和KC的水平。

重要的是，我们发现在IL-10KO小鼠中应用IL-22阻断剂时，双歧杆菌处理的小鼠体重严重减轻，与PBS处理的对照小鼠的体重减轻相当。两组的组织学评分也具有可比性。这些结果表明，IL-22和IL-10是双歧杆菌改善肠道免疫病理所必需的。

双歧杆菌增强Treg细胞的线粒体代谢

除了对免疫细胞功能的影响外，肠道微生物群还可能影响宿主细胞代谢。我们用双歧杆菌治疗组和对照组小鼠的血清进行了基于质谱的代谢物分析。有趣的是，我们发现双歧杆菌治疗增加了血清亚油酸的水平，亚油酸是一种代表线粒体活性的酸，经常在脂质代谢紊乱的患者中检测到。然后，我们用基因本体（GO）分析来评估来自分类的结肠LP-Tregs的基因表达数据。与上述结果一致，我们发现双歧杆菌治疗组与对照组相比，与代谢过程和线粒体组织相关的生物途径丰富。基因集富集分析（GSEA）显示，4个与代谢直接相关的基因集，包括“胆汁酸代谢”、“过氧化物酶体”、“脂肪酸代谢”和“胆固醇稳态”，代表了双歧杆菌治疗后结肠Tregs基因表达上调。

为了探讨双歧杆菌对Tregs线粒体体积和功能的影响，我们用荧光探针对Tregs细胞进行染色，以监测线粒体体积和膜电位。流式细胞术数据显示，与PBS组相比，双歧杆菌治疗组的Treg在线粒体体积和线粒体应激方面均表现出增加。与这一发现一致，与线粒体功能和线粒体结构成分相关的多个基因在双歧杆菌治疗下显著上调。总之，这些结果表明，双歧杆菌调节代谢过程和增强线粒体活性的肠道树突。

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