项目文章菌群研究揭示中药治疗肠炎机制

●期刊：FrontiersinPharmacology

●IF：5.

●发表时间：.04

前言

苍术素（Atractylodin,ATL）是苍术主要活性成分，是苍术中国药典质量控制指标。之前报道表明，苍术素在治疗关节炎、肺炎等炎症疾病有较好的应用前景。上半年，湖北中医药大学刘艳菊课题组在药理学前沿FrontiersinPharmacology杂志（IF=5.,JCRQ1,中科院2区）在线发表了题为AtractylodinAttenuatesDextranSulfateSodium-InducedColitisbyAlleviatingGutMicrobiotaDysbiosisandInhibitingInflammatoryResponseThroughtheMAPKPathway的研究成果，揭示了苍术素抗炎作用机制，并考察了其治疗结肠炎的药效。博士生瞿领航和硕士生林雄为共同第一作者。刘艳菊教授和曹国胜博士为共同通讯作者。

溃疡性结肠炎是一种病因不明的慢性炎症性肠病，影响结肠和直肠。它是炎症性肠病的两种形式之一(IBD)。溃疡性结肠炎的特点是粘膜炎从直肠开始，逐渐延伸到近端结肠。近来，全球溃疡性结肠炎的发病率正在稳步上升。

目前，溃疡性结肠炎的药物治疗主要基于以下四种基本药物类别:5-氨基水杨酸盐(5-ASA，美沙拉秦)、类固醇、免疫抑制剂和生物药物。5-ASA仍然是局限于轻度或中度溃疡性结肠炎患者的一线治疗方法，只有60%的轻度至中度溃疡性结肠炎患者使用美沙拉秦获得缓解。但是抗肿瘤坏死因子药物可能会增加严重感染和癌症的风险。因此，迫切需要对溃疡性结肠炎进行有效的治疗。越来越多旨在发现新颖有效的天然产品的研究正在进行。

据报道，从蔬菜、水果和草药中分离出的几种天然产物可有效治疗小鼠溃疡性结肠炎。在这些化合物中，我们对苍术素更感兴趣，苍术素是从苍术中获得的一种天然化合物，以其抗炎作用而闻名。然而，苍术素是否能改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎，是否能调节肠道微生物的丰度，尚未见报道。目前还不清楚苍术素的抗炎作用是否与抑制巨噬细胞活化有关。

NO.1

苍术素能改善小鼠溃疡性结肠炎

的病理症状

A图展示了苍术素的分子结构。B图为动物实验的设计，其中SASP为柳氮磺吡啶，用于溃疡性结肠炎的治疗。C-G图显示相当于模型组，苍术素对于小鼠体重，疾病严重程度，结肠长度以及炎性浸润的显著改善。

NO.2

苍术素能改善溃疡性结肠炎小鼠

的肠道屏障

与正常组相比，模型小鼠结肠中杯状细胞的数量显著减少。苍术素治疗后，结肠杯状细胞的数量显著增加(图A)，结肠中MUC2的表达显著增加(图B)，紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达显著增加(图C，D)。

NO.3

苍术素能改善溃疡性结肠炎小鼠

的肠道炎症

模型小鼠中，促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6的水平显著升高。苍术素治疗后，促炎细胞因子水平显著降低(图3A)。此外，模型小鼠中，F和iNOS被确定为显著升高，而在苍术素治疗后，这些水平显著降低(图3B)。模型小鼠中，MAPK途径蛋白的表达，如磷酸化p38、磷酸化JNK和磷酸化ERK，在结肠组织中显著上调(图3C)。苍术素治疗后，结肠组织中磷酸化p38(图3D)、磷酸化JNK(图3E)和磷酸化ERK水平(图3F)显著下调。

NO.4

苍术素能抑制巨噬细胞MAPK通路和炎症因子的表达

细胞活力测定显示，苍术素对RAW.7细胞无细胞毒性(图A)。LPS刺激RAW.7细胞24h后，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6和iNOS的mRNA水平显著升高。苍术素干预24h后，白细胞介素-1β、白细胞介素-6和iNOS的表达均有不同程度的下降(图B，C–E)。在LPS诱导的巨噬细胞中，包括磷酸化p38、磷酸化JNK和磷酸化ERK在内的MAPK途径蛋白被上调(图F)。用不同浓度的苍术素处理后，巨噬细胞中磷酸化p38(图G)、磷酸化JNK(图H)和磷酸化ERK(图I)下调。

NO.5

苍术素能靶向作用GAPDH，抑制炎症过程

发现TNF-α在LPS处理的巨噬细胞的上清液和裂解物中高度表达；然而，用不同浓度的苍术素处理后，其水平有不同程度的降低。前期研究表明，苍术素不能抑制tnf-a的mRNA水平的表达。用20μM(p0.05)苍术素处理后，肿瘤坏死因子-α蛋白的表达显著降低，在40μM(p0.01)苍术素处理后，肿瘤坏死因子-α蛋白的表达显著降低(图A，B)。LPS处理的巨噬细胞上清液中的乳酸水平显著增加，而用不同浓度的苍术素处理导致降低。用20μM(p0.05)的苍术素治疗后，乳酸水平显著降低，用40μM(p0.01)的化合物治疗后，乳酸水平极显著降低(图C)。苍术素和GAPDH的分子对接实验显示结合自由能为5.42千卡/摩尔(图D)，表明GAPDH可能是苍术素的抗炎靶点。研究了苍术素对GAPDH活性的影响，发现其活性随着苍术素浓度的增加而逐渐降低(图E)。然而，不同浓度的苍术素并不影响GAPDH蛋白的表达(图5G)。在LPS处理的巨噬细胞中，总蛋白的丙二酰化显著增强，还发现苍术素可以抑制这一过程(图F)。免疫沉淀分析结果显示，苍术素可以显著抑制GAPDH蛋白的丙二酰化(图H)。

NO.6

苍术素能改善溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群

累积物种曲线显示，三个样本中存在近种肠道微生物，基本上涵盖了常见物种(图A)。正常组和苍术素组共有的常见肠道细菌数量明显高于正常组和模型组的共有(图B)。物种水平的等级曲线显示，正常组的肠道菌群丰度最高，模型组最低。苍术素组的肠道菌群丰度介于正常组和模型组之间(图C)。聚类分析显示，正常组和模型组的微生物区系组成显著分离，而苍术素处理组的微生物区系组成接近正常组(图D)。主成分分析和主坐标分析表明，正常组和模型组肠道菌群分布分离良好，而苍术素和正常组紧密聚集(图E)。本研究不同鼠群中丰度最高的前20属和前20门的分布图分别如图6F、G所示。在DSS处理后，厚壁菌门的丰度显著降低，但在苍术素组中显著增加。DSS处理后，变形菌和除铁菌的丰度显著增加，而用苍术素处理导致它们的丰度显著降低(图H)。DSS建模后，病原菌的丰度显著增加，包括螺杆菌、脱硫弧菌、拟杆菌、黄杆菌和粘杆菌，而有益菌的丰度显著降低。苍术素处理不仅降低了这些病原菌的丰度，还增加了包括阿克曼氏菌在内的有益菌的丰度(图I)。

本研究探讨了苍术素对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其机制。文章发现苍术素可以显著逆转DSS诱导的溃疡性结肠炎的效应，如体重减轻、疾病活动指数评分；缩短结肠长度，逆转小鼠结肠病变。在溃疡性结肠炎小鼠模型中，苍术素能抑制结肠巨噬细胞的活化，抑制MAPK通路，减轻肠道炎症。此外，它可以通过抑制紧密连接蛋白ZO-1、occludin和MUC2的减少来保护肠屏障。此外，苍术素还能减少小鼠肠道内有害菌的数量，增加有益菌的数量，有效改善肠道微生态。在脂多糖诱导的巨噬细胞模型中，苍术素可以抑制巨噬细胞的MAPK通路和炎症因子的表达。苍术素还能抑制糖酵解终产物乳酸的产生；抑制糖酵解中重要限速酶GAPDH的活性；抑制GAPDH的丙二酰化，从而抑制TNF-α的翻译。因此，本研究首次突出了苍术素治疗溃疡性结肠炎的潜力，并揭示了其可能的机制。

肠道菌群能和几乎各临床子学科建立关联研究，同时也容易受到国内各种自然基金的资助和青睐。国际上也有不少研究肠道微生物的大计划，比如被誉为生命科学的“登月计划”的人类微生物组计划，还有我国的“中科院人类微生物组计划”。肠道微生物的研究已经成为目前最为火热的研究方向。

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