文献分享针对miRNA治疗的研究进展

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大家好！今天主要分享目前针对miRNA治疗的一些研究进展。

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约17-24nt的长的小的非编码RNAs，通过与mRNA的3’UTR或者开放阅读框ORF区域结合，能介导基因的转录后沉默。miRNA与细胞增殖分化、迁移、疾病发生和疾病进展都有关系。

miRNA的发现和特征

miRNA首先是哈佛大学的VictorAmbros和GaryRuvkun在线虫中发现的，并命名为LIN-4.第二个miRNAlet-7由哈佛大学博士后FrankSlack发现。　miRNA的主要特征有：(1)长度约为21nt的单链非编码小RNA；(2)进化过程中高度保守；(3)通过与靶基因的3’UTR区域特异性结合，诱导靶mRNA的降解或阻遏其翻译；(4)预计调控60％的蛋白编码基因，并参与近乎所有已知的细胞进程。

miRNA的产生和作用机制

首先miRNA是由基因组的非编码区产生的。在RNA聚合酶Ⅱ的帮助下转录生成初级miRNA。然后Ⅲ型核糖核酸酶Drosha与辅因子蛋白DGCR8一起与初级miRNA（pri-RNA）结合，切割初级miRNA（Pri-RNA）产生前miRNA（pre-miRNA）。接着，Exportin5和RAN-GTP复合物介导pre-miRNA从细胞核移动到胞浆。RnaseⅢDicer和TARRNA结合蛋白（TRBP）与前miRNA结合并切割末端环，形成RNA双链。然后，RNA诱导沉默复合物（RISC）负责将配对的miRNA分开，成为成熟的miRNA。最后，成熟的miRNA与靶mRNA结合，从而导致转录的抑制或者mRNA的降解1。

图1：miRNA的产生和作用机制针对miRNA治疗的方式

1.miRNAantagomir

miRNAantagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与miRNA结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。主要特征有：(1)单链，与需要抑制的miRNA序列互补配对；(2)有效的抑制内源性成熟miRNA功能；(3)较低的浓度就能高效长久的抑制miRNA活性。下面我来列举一些miRNAantagomir的体内实验的一些案例。

08年的一篇nature详细介绍了一种特殊化学修饰的miRNAantagomir。它利用了锁核酸LNP（一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。在2-O-和4-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3-内构象）和硫代寡核苷酸骨架，极大的增强了miRNAantagomir的稳定性。这也是这篇文章最创新的部分。作者分别从以下几个方面介绍这种miRNAantagomir的抑制效能。因为之前有文章报道过miRNA-参与调控脂质代谢的能力，所以作者用了这种特殊修饰的miRNAantagomir，想看它是否能够spongemiRNA-来调控脂代谢。首先，作者通过Northernblot证明了完全硫代磷酸主干（PS）比硫代磷酸和磷酸骨架的混合物（PS/PO），或者没被修饰的磷酸骨架(PO)，抑制miR-表达的能力更强（Fig2.a）。然后运用QPCR技术，证明miR-的靶标mRNA的水平得到了回补（Fig2.b）。随后，作者通过不同浓度的miRNAantagomir，根据血浆胆固醇的含量计算出了中位有效剂量为10mg/kg（Fig2.c）。接着作者证明了LNA修饰的miRNA拮抗剂比空白对照生理盐水组或者阴性对照LNA错配组有更强的抑制血浆胆固醇合成的能力（Fig2.d）。当然作者也证明了这种LNA修饰的miRNA拮抗剂有抑制miRNA-的能力，并且回补了其下游的靶标（Fig2.e，f）1,2。

图2：锁核酸LNP修饰的应用

15年的一篇Nature也详细介绍了miRNA　antagomir的另一种修饰方式，将肽核酸antimiRs与含有pH诱导膜转移结构（pHLIP：AlexaFluor）的多肽结合，所得到的产物能靶定肿瘤微环境，在酸性条件下帮助antimiR横穿质膜（Fig3.c）。并且帮助antimiR避开肝脏的清除，辅助其通过非内吞途径进入细胞。作者通过尾静脉注射pHLIP-antimiR-，可以看出无论是皮下瘤小鼠模型或者弥散性的淋巴结肿瘤的模型，都能看出其避开肝脏的清除，靶向肿瘤（Fig3.a，b）3。

图3：pHLIP修饰的应用

miRNAantagomir的另一种修饰方式是2甲氧基修饰（2-O-meyhyl）。已知miRNA-参与调控脂质代谢。所以作者想证明用这种修饰的ASO在小鼠体内抑制miR-的能力。可以看出miR-ASO的注入后，脂肪酸氧化增加和脂肪酸合成减少（Fig4.a）。并且无论在细胞或者细胞悬液中的固醇合成速率都会下降（Fig4.b）。然后作者通过QPCR检测脂质代谢相关基因在离体肝细胞中的mRNA水平，可以看出miR-ASO的加入后，脂质代谢相关基因显著下调（Fig4.c）。因为之前报道ACC2的下调或活化AMPK的增加可能导致脂肪酸氧化增加。WB结果显示，ASO治疗的小鼠肝提取物中AMPK-1α会被磷酸化（Fig4.d）4。

图4：2-O-meyhyl修饰的应用

2.miRNAmimic

miRNAmimic是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。主要特征有：(1)双链，与相应的miRNA序列相匹配；(2)有效的抑制内源性成熟miRNA功能；(3)较低的浓度就能高效长久的抑制miRNA活性。

14年发表在EMBOMolecularMedicine的一篇文章引入了miRNA　mimic的一种新的方式。作者通过如图所示的修饰方式，极大的提高了miRNAmimic在生物体内的稳定性（Fig5.a）。在小鼠NIH3T3细胞转染实验表明，随着miR-29bmimic数量的增加，能有效的降低其靶基因Col1a1的表达（Fig5.b）。并且在所有测量的组织中，miR-29bmimic在肺和脾中维持时间最长（Fig5.c，d，e，f）4。

图5：miRNAmimic的应用实例

21年发表在moleculertherapy的一篇文章。作者研究了右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠和恢复期小鼠的粪便微生物组组成和miRNA丰度，以探索不同的miRNA表达，它们与微生物丰度的关系，以及它们对结肠炎的影响。作者发现，从结肠炎恢复的小鼠粪便中miR-a-3p的表达显著增加，并且它可以以微生物组依赖的方式缓解DSS治疗小鼠的疾病症状。miR-a-3p通过调节PolyA和位点标记LREU_RS的转录物，促进了罗伊氏乳杆菌的生长，该菌在从结肠炎恢复的小鼠的粪便中具有高丰度。此外，罗伊氏乳杆菌及其代谢产物ｒｅｕｔerin可以缓解DSS诱导的疾病症状。这些结果强调了粪便miR-a-3p在预防结肠炎中的作用（Fig6）5。

图6：miRNAmimic的应用实例

接下来的一个例子是年发表在cancer　research的一篇文章。之前已经报道miR-34a在许多类型的癌细胞中显示出抗增殖表型。所以作者发现无论是局部miR-34amimic的局部注射还是尾静脉注射都可以达到很好的一个抑制肺癌肿瘤生长的一个现象（Fig7）。并且作者也证明了静脉注射miR-34amimic不会引起血清中细胞因子或肝肾酶的升高，这表明该制剂具有良好的耐受性，并且不会诱导免疫反应（Fig8）6。

图7：miRNAmimic的应用实例图8：miRNAmimic的应用实例

3.人工合成的circRNA

人工合成的circRNA它主要是模仿生物体内CircRNA吸附miRNA的方式对miRNA进行抑制。人工合成和设计的针对miRNA的sponge序列。

第一个例子是年发表在Chem.Sci的一篇文章，首先作者设计了３种DNA纳米管结构（单链，双链和发卡），上面暴漏miRNA的结合位点（Fig9）。作者首先通过QPCR证明了miR-在H细胞中高度上调，而在MCF-7细胞中miR-21过度表达（Fig10.a）。然后分别证明了NTR和NTR都具有sponge的效果（Fig10.b-f）。并且线性的ＤＮＡ纳米管具有更强的吸附效应（Fig10.d，f）7。

图9：circRNA的应用实例图10：circRNA的应用实例

接下来我主要分享的一篇文章是发表在MolecularTherapy上的一篇文章。

这篇文章的背景是：心力衰竭是很多心血管疾病晚期的共同特征，它在全世界都有着高发病率和死亡率，并构成重大的医疗负担，迫切需要新的治疗方法。miRNA在正常发育和动态平衡中起着至关重要的作用，其失衡涉及各种疾病的发病机制。因此，靶向miRNA是一条可利用的治疗途径。circRNA的经典功能是作为miRNA海绵，如果circRNA作为药物，可以解决半衰期短、脱靶效应和非代谢分子积累等传统药物缺点。

首先作者设计了miRNA结合位点（MBS），设计了一个缺失和三个错配引入凸起的结合位点。防止合成的完全匹配的circRNA与miRNA结合后被体内Dicer酶降解（Fig11.a）。然后作者设计了携带总共12个交替凸出的miRNA结合位点的序列，miR-和miR-各6个，miRNA结合位点之间有6个核苷酸（nt）分离（Fig11.b）。为了使miRNA海绵成环，作者将序列插入到反向互补内含子中间（Fig11.c）。随后的circmiR的头-尾连接通过QPCR检测，并通过Sanger测序确认（Fig12.d）。作者也比较了这种反向互补的内含子序列的长短与其有效的成环是否具有相关性，可以发现长的互补序列更容易成环（Fig12.e）。

图11：设计和环化了miRNA的sponge序列

接下来，为了验证circmiR功能，作者将miR-和-结合位点插入来自双荧光素酶报告系统的Renilla荧光素酶构建体的3’UTR区。可以看出该构建物与miR-和miR-模拟物共同转染到HEKT细胞中会导致肾素活性显著降低。在引入携带凸起miRNA结合位点的circmiR后，与引入干扰miR结合位点的阴性对照海绵（circScram）相比，Renilla活性得到显著恢复（Fig12.a）。接下来作者通过测试不同间隔区长度、结合位点类型和结合位点总数的影响来优化circmiR结构设计。因为圆形结构中的短间隔序列可能会对相邻的结合位点施加张力，影响miRNA结合，所以作者构建了具有不同间隔物长度的凸起圆环。可以发现间隔区大小大于12nt荧光酶被有效的回补（Fig12.b）。然后作者还构建了含有2、6、8、12和16个miRNA结合位点circmiR构建体，并由12个nt间隔子分隔。证明了荧光酶的回补效果随着miRNA结合位点增多而增强（Fig12.c）。在线性海绵序列中，凸起的miRNA结合位点优于完全匹配的结合位点，因为完全匹配的结合位点在miRNA结合时通过RISC介导的内切核裂解导致降解。所以作者将Circmir与凸起或完全匹配的miRNA结合位点进行比较。无论间隔区大小如何，完美CircmiR的表达都无法挽救Renilla活性。然而，凸起的圆环体持续地拯救了Renilla的表达，并且这种效应像之前证明的一样受到其间隔区大小的影响（Fig12.d）。作者也证明了完全匹配会导致circRNA急剧降解（Fig12.e）。

图12：合成的CircRNA可以有效吸附miRNA

之前已经证明肥大刺激上调心肌细胞miR-和miR-的表达，并且作者之前也证实了横向主动脉缩窄（TAC）心脏压力超负荷小鼠模型中miR-和miR-的上调。所以作者想验证自己设计的circmiR能否在体内有效的抑制miR-和miR-的表达。首先，作者在TAC手术前1周腹腔内注射表达CircScram、circmiR或线性miR/海绵（linsp）的AAV载体。（Fig14.a）。通过QPCR验证他们在心肌细胞都能表达（Fig14.b）。circmiR和linsp小鼠组心肌肥大的一些生化指标都有所改善。通过每周超声心电图测量评估心功能。射血分数（心脏收缩功能的一个参数）在TAC手术的CircsRam小鼠中显著受损，而circmiR和linsp小鼠组在TAC后4周内心脏功能的都有所改善（Fig14.c）。另外与circScram组相比，circmiR组和线性海绵组在TAC后，室间隔（IVS）和左室后壁（LVPW）厚度显著降低。压力超负荷导致病理性心肌壁增厚（Fig14.d-e）。心脏重量与胫骨长度之比是衡量心脏肥大的另一个指标，在circScram和linsp小鼠中，心脏重量与胫骨长度之比在TAC后均增加，而在CIRCMIR小鼠中，心脏重量仍与正常水平相似（Fig15.f）。形态学上，circScram和linsp小鼠的心肌细胞（CM）直径增加趋势比circmiR小鼠更明显（Fig15.g）。TAC手术后，典型CM应激标记物Nppa、Nppb和Myh7。也随着circmiR治疗后得到恢复（Fig15.h）。然后作者发现体内circmiR和linsp组检测到的miR-和-的丰度更高。然而在体外细胞实验，circmiR和linsp确实降低了T中ｍｉＲ-/的丰度。作者解释可能是由于体内外环境的不同导致的（Fig15.i）。

图13：circmiR治疗减轻压力超负荷引起的肥大

随后作者利用置换内含子-外显子（PIE）方法体外合成CircmiR。在自催化剪接过程中，发生两步酯交换反应（闪电符号），导致miRNA海绵序列两端的连接（Fig16.a）。并且体外转录合成的CircmiR被证实对RNaseR降解具有抗性（Fig16.b）。可以发现合成的miRNA显著地将海肾荧光素酶的活性挽救了4倍以上，且比线性的更明显（Fig16.c）。

图14：通过置换内含子-外显子（PIE）方法体外合成CircmiR

最后为了探究miRNA的稳定性，在T细胞中加入了actinomycinD（一种抑制RNA转录的一个药物）。可以发现质粒表达的CircmiR的RNA水平在72小时内保持稳定（Fig17.a）。同理作者也证明了合成的circmiR的稳定性（Fig17.b）8。

图15：circRNA不易被内源性核酸酶降解小结

总之，目前针对miRNA治疗的药物多种多样，主要是为了提高药物在体内的稳定性和靶向性，它们对于肿瘤治疗提供了一种全新的策略。但是由于miRNA作用的基因较多，很难做到特异性的基因沉默。因而如何提高其特异性是miRNA药物未来需要解决的一个比较重要的问题。

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作者：wjh审核：sjzpf排版：gc

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